甲基丙烯酰胺衍生物的新发现—既能作为共价抑制剂又应用于功能化荧光成像！

团队研究了α-取代基对于甲基丙烯酰胺和GSH反应的效率及反应性质的影响。合成了一系列14种包含各种α取代的n-苄基甲基丙烯酰胺的模型化合物（表1），通过LC-MS对于GSH在这个反应中的浓度变化进行量化，计算其反应速率，同时根据质谱结果确定其反应是取代反应还是加成反应。为了更加直观地表示反应结果，团队将α-取代基改变为7-羟基香豆素，通过荧光性质的变化分析反应速率（图2 C-F）。并且分析了取代基的酸碱性（对于酸用PKa，碱则用PKb衡量）对反应速率的影响（图2B）。团队发现，胺类作为碱性α-取代基会大大增加反应速率，而吸电子酸性取代基的PKa越小，则利于这类反应的发生。

随后，团队为了在不可逆共价抑制剂的背景下评估这种化学反应，选择了Ibrutinib作为模型化合物。Ibrutinib是布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的一种不可逆抑制剂，并已被FDA批准用于几种B细胞癌源性恶性肿瘤。团队合成了具有不同α-取代基的丙烯酰胺衍生物（当R=H时即为Ibrutinib）。在BTK通路抑制速率方面，发现了与表1中的模型化合物与GSH反应速率相一致的特征。酯、羰基酯和其他碱性胺取代的四种3c、3h、3i和3e化合物具有较高的BTK抑制能力，其B细胞信号通路激活能力也与Ibrutinib相近，表现出其作为模型化不可逆共价抑制剂的潜力。在这之后，团队研究了α-取代丙烯酰胺衍生物的共价配体定向释放能力以及其作为定向检测型荧光探针的潜力。由于某个特定的离去基团会因靶蛋白的选择性结合被释放，这类衍生物可以用于检测型荧光探针。为了评估该方法的适用性和通用性，团队选择了三个具有丙烯酰胺抑制剂的治疗靶点：BTK、EGFR和KRASG12C作为模型系统。利用7-羟基香豆素作为离去基团的荧光特性，在加入BTK后，在435 nm处的3k的荧光强度增加了30倍，在10分钟内以极快的速率达到平衡。同样地，在其他两种通路的共价抑制剂香豆素衍生物中也检查到了同样的性质（图4）。为了验证荧光的增加是由于与BTK结合后香豆素的释放，我们重复了与Ibrutinib的预孵育的BTK实验，发现了在Ibrutinib被3k逐渐替代的过程中有着缓慢的荧光增加，表示经由香豆素的释放过程